Fluorescencia | aplicaciones

Aplicaciones

Existen muchos compuestos naturales y sintéticos que exhiben fluorescencia, y tienen un sinnúmero de aplicaciones prácticas, desde la simple decoración fluorescente hasta aplicaciones en química analítica tales como FPIA. En la naturaleza hay múltiples ejemplos de organismos que utilizan la fluorescencia y en especial la quimioluminiscencia para atraer alimento o pareja, o bien para espantar a los depredadores.

Iluminación

Pintura y plástico fluorescentes iluminados por luz Ultravioleta. (artista: Beo Beyond)

El común tubo fluorescente depende de la fluorescencia. Dentro del tubo de vidrio hay un vacío parcial y una pequeña cantidad de mercurio. Una descarga eléctrica en el tubo causa que los átomos de mercurio emitan luz. La luz emitida se encuentra en el rango ultravioleta (UV), y es por lo tanto invisible para nuestros ojos; pero el tubo se encuentra revestido con una capa de un material fluorescente llamado fósforo, el cual absorbe la luz ultravioleta y la reemite en el espectro visible. La iluminación fluorescente es energéticamente mucho más eficiente que la tecnología incandescente, pero el espectro producido puede hacer que ciertos colores no parezcan naturales, esto es así porque el espectro de emisión no es continuo, sino que se encuentra formado por un limitado número de longitudes de onda ( líneas de emisión).

A mediados de los años 1990, ya era tecnología común el LED de luz blanca, este tipo de LED funciona a través de un proceso similar. Típicamente, en estos dispositivos el semiconductor emisor produce luz en la parte azul del espectro, la cual choca con un compuesto fluorescente depositado en el chip; y este fluorescente emite en la región verde y roja del espectro. La combinación de la luz azul que pasa a través del fluorescente y la luz emitida por el mismo produce una luz casi blanca.

La Lámpara fluorescente compacta (CFL) funciona de la misma forma que cualquier tubo fluorescente típica y con ventajas. Es utilizada para reemplazar lámparas incandescentes en muchas aplicaciones. Producen un cuarto del calor por lumen emitido que los bombillos incandescentes y duran hasta cinco veces más. Estas lámparas contienen mercurio y deben ser manejadas y dispuestas con cuidado. Las desventajas de que estas lámparas tengan un balastro es que no encajan adecuadamente en todos los aparatos de luz. Todas las lámparas fluorescentes tienen un retraso significativo al momento de ser encendidas comparadas con las lámparas incandescentes, una desventaja en algunas aplicaciones. Adicionalmente, la tecnología que les permite ser usadas también reduce significativamente su vida útil y su fiabilidad en aplicaciones de luz crepuscular, por ejemplo al utilizarlas con los famosos atenuadores o dimmers.

Química analítica

La fluorescencia puede ser detectada con un monocromador para encontrar emisiones típicas de compuestos presentes en una cromatografía líquida de alta eficacia. Además, permite visualizar las manchas producidas por una TLC si los compuestos o los reactivos de reveladores son fluorescentes.

La fluorescencia es más efectiva cuando hay una gran proporción de átomos en los niveles bajos de energía en una distribución de Boltzmann. Existe entonces una mayor probabilidad que los átomos con energía baja sean excitados y liberen a su vez fotones, permitiendo así un análisis más eficiente.

Las huellas dactilares pueden visualizarse con compuestos fluorescentes como la ninhidrina.

Bioquímica y medicina

Las biomoléculas pueden marcarse con un grupo químico fluorescente ( fluorocromo) mediante una reacción química simple, lo cual permite una detección sensible y cuantitativa de la molécula. Algunos ejemplos:

  • La microscopía de fluorescencia de tejidos, células o estructuras subcelulares se consigue marcando el anticuerpo con un fluorocromo y permitiendo que aquél encuentre su antígeno correspondiente presente en la muestra. Al marcar varios anticuerpos con diferentes fluorocromos se puede lograr la visualización de múltiples objetivos dentro de una misma imagen.
  • Secuenciación automática de ADN por el método de terminación de la cadena: cada uno de los cuatro ddNTP se encuentra marcado con un fluorocromo específico, de tal forma que se generan cadenas de diferente longitud que al ser sometidas a una fuente de UV se puede determinar la base nitrogenada terminal de cada cadena debido a la longitud de onda emitida característica de cada fluorocromo.
Electroforesis en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. El bromuro de etidio se intercala en el ADN y fluoresce naranja cuando se expone a luz UV.
  • Detección de ADN: el compuesto bromuro de etidio, libre de cambiar su conformación en disolución, tiene poca fluorescencia. La fluorescencia del bromuro de etidio se aumenta enormemente cuando se une al ADN, de tal forma que este compuesto es muy útil para visualizar la localización de fragmentos de ADN en el método de electroforesis en geles de agarosa. El bromuro de etidio puede ser tóxico, por tanto una alternativa más segura es teñir con SYBR Green.
  • Microarreglos
  • Inmunología: los sitios de unión de un anticuerpo a un espécimen microscópico por ejemplo, pueden ser vistos, e incluso cuantificados, empleando la fluorescencia si se le ha unido previamente un grupo químico fluorescente al anticuerpo específico ( IFI).
  • La fluorescencia ha sido empleada para el estudio de la estructura y conformación del ADN, así mismo como de proteínas, con técnicas como la transferencia de energía de resonancia, la cual mide distancias a nivel de angstroms. Lo anterior es especialmente importante en complejos de biomoléculas múltiples.
  • Es utilizada en ( Citometría) de flujo para identificar diferentes receptores en las células estudiadas, marcando estas células con anticuerpos específicos conjugados a un fluorescente.
  • La Proteína Verde Fluorescente (GFP), de la medusa Aequorea victoria, se ha convertido en una herramienta de investigación muy importante. GFP y otras proteínas relacionadas son usadas como reporteros de un sin número de eventos biológicos incluyendo aquellos de localización subcelular. Los niveles de expresión génica son medidos en algunas ocasiones uniendo el gen de producción de GFP con el gen de interés.

También, diversas moléculas biológicas tienen fluorescencia intrínseca y por tanto, pueden ser empleadas sin necesidad de unirlas a una etiqueta química. Algunas veces, esta fluorescencia intrínseca cambia cuando la molécula se encuentra en un ambiente específico, de tal forma que la distribución o el ligamiento de la molécula pueden ser medidos. La bilirrubina, por ejemplo, es altamente fluorescente cuando se une a la albúmina sérica en un sitio específico. La protoporfirina zinc, la cual se encuentra en las células sanguíneas cuando la producción del grupo hemo es inhibido por la existencia de plomo o la ausencia de hierro en la sangre, tiene una fuerte fluorescencia y puede ser, por tanto, empleada para detectar estos problemas.

El número de aplicaciones de la fluorescencia ha ido creciendo en el campo de la biomedicina, la biología y en otras ciencias relacionadas. Los métodos de análisis en estos campos también han ido aumentando: FPIA, FLIM, FLI, FLIP, CALI, FLIE, FRET, FRAP, FCS, PFRAP, smFRET, FRIPS, SHRIMP o TIRF. Muchas de estas técnicas se basan en los microscopios de fluorescencia. Los microscopios utilizan fuentes de luz de alta intensidad, usualmente lámparas de mercurio o xenón, LED’s, o láseres, para generar fluorescencia en las muestras bajo observación. Posteriormente, los filtros ópticos separan la luz excitada de la fluorescencia emitida, para permitir que sea detectada a simple vista, empleando una cámara o utilizando algún otro detector de luz como espectrógrafos, etc. Muchas investigaciones se están llevando a cabo para mejorar ya sea el desempeño de estos microscopios, las sondas fluorescentes usadas, y las aplicaciones de las mismas. De interés particular son los microscopios confocales, los cuales utilizan un poro para lograr secciones ópticas, proporcionando una vista cuantitativa y en 3D de la muestra.

Gemología, mineralogía, geología y ciencias forenses

Las gemas, los minerales, las fibras y muchos otros materiales que pueden ser encontrados en medicina forense, pueden tener una fluorescencia distintiva o pueden fluorecer diferente bajo luz ultravioleta de onda corta, de onda larga, o rayos X: Muchos tipos de calcita y ámbar presentarán fluorescencia bajo luz ultravioleta de onda corta. Los rubíes, las esmeraldas y el diamante Hope exhiben fluorescencia roja bajo luz UV de onda corta; los diamantes también emiten luz bajo rayos X.

El petróleo emite fluorescencia en un rango de colores, desde el marrón mate para aceites pesados y alquitrán hasta el amarillento y blanco azulado para los aceites muy livianos y condensados. Este fenómeno es usado en perforaciones hechas para la exploración de petróleo permitiendo identificar pequeñas cantidades de crudo en las perforaciones y en los poros de las muestras.

Líquidos orgánicos

Los líquidos orgánicos, como las mezclas de antraceno en benceno o tolueno, emiten fluorescencia bajo la acción de radiación UV o rayos gamma. Los tiempos de decaimiento de esta fluorescencia se encuentran en el orden de los nanosegundos ya que la duración de la luz depende del tiempo de vida de los estados excitados del material fluorescente, en este caso antraceno.

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