ADN ligasa | participación de la adn ligasa en procesos de clonación

Participación de la ADN ligasa en procesos de clonación

Para la clonación de las cadenas de ttttg ADN se utilizan vectores plasmídicos, pequeñas moléculas circulares de doble cadena, derivados de grandes plásmidos (moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican y transcriben independientemente del ADN cromosómico) que aparecen de forma natural en casi todas las bacterias y ciertos levaduras. Como norma general suponen un pequeño fragmento del ADN total de la célula del huésped pero se pueden separar debido a su pequeño tamaño con respecto a las moléculas de ADN cromosómico de tamaño superior y que sedimentan por centrifugación.

Para poder utilizar los plásmidos circulares como vectores de clonación, el primer paso es purificarlos. Una vez se han purificados estos vectores de clonación se cortan con una nucleasa de restricción (estas nucleasas son enzimas que cortan el ADN de doble cadena cuando éstas reconocen un patrón de secuencia específico) para generar moléculas lineales. Por su parte el ADN genómico de la célula que se va a utilizar en la construcción de la genoteca es cortado con la misma nucleasa de restricción; los fragmentos de restricción resultantes (entre los que se encuentran los que contienen el ADN que va a ser clonado) se añaden a los plásmidos cortados y se cierran, formando moléculas circulares de ADN recombinante. Estas moléculas recombinantes, que contienen injertos de ADN ajeno, se unen covalentemente mediante la enzima ADN ligasa.

El siguiente paso en la preparación de la genoteca consiste en introducir las moléculas circulares de ADN recombinante en bacterias temporalmente permeables al ADN; se dice que estas células han sido transfectadas con el plásmido. A medida que estas células van creciendo y dividiéndose - duplican su número cada 30 minutos- los plásmidos recombinantes también se van replicando y produciendo un número enorme de copias de ADN circulantes que contienen ADN ajeno.

Inserción de un fragmento de ADN en un plásmido bacteriano mediante la enzima ADN ligasa. El plásmido se abre realizando un corte con una nucleasa de restricción ( en este caso una que produce extremos cohesivos) y se mezcla con el ADN ligasa, ATP y el fragmento de ADN que se desea clocar ( el cual ha estado preparado con la misma nucleasa de restricción). Los extremos cohesivos se aparean entre si y la ADN ligasa sella los cortes de la cadena de ADN, produciendo una molécula de ADN completa
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