Секвенирование древней ДНК

Древняя ДНК (aDNA, дДНК) — это ДНК, извлечённая из древних биологических образцов, таких как палеонтологические и археологические находки, мумифицированные останки, засохшие остатки растений, копролиты. В широком смысле под древней ДНК понимается любая частично деградировавшая ДНК, извлечённая из образцов, длительное время подвергавшихся воздействию среды. Исследования древней ДНК позволяют устанавливать филогенетические отношения между видами и проверять гипотезы о связи изменений в окружающей среде и эволюционных изменений популяций, а также предоставляют информацию для калибровки молекулярных часов [1].

Технические сложности

Деградация ДНК

Обычно после смерти организма ДНК расщепляется эндогенными нуклеазами. Этого не происходит, если нуклеазы оказываются быстро разрушены или инактивированы, например, вследствие обезвоживания останков, низких температур или большой концентрации соли. [2] Даже в этом случае ДНК со временем повреждается в результате случайного гидролиза или окисления. К гидролитическим повреждениям относятся разрушение фосфатного остова цепи, депуринизация ( на англ.) (соответствующая позиция остается без азотистого основания) и дезаминирование. Чаще происходит дезаминирование цитозина в урацил, метилированный цитозин (5-метил-цитозин) дезаминируется в тимин; реже аденин превращается в гипоксантин, который комплементарен цитозину, а не тимину, что ведет к неправильному прочтению при секвенировании. Эти повреждения происходят и в живых клетках, однако там они устраняются в процессе репарации. Кроме того, возникают поперечные сшивки между цепями спирали ДНК из-за алкилирования или сшивки ДНК с различными молекулами в результате реакции Майяра. Как и разрывы цепи, поперечные сшивки мешают амплификации при ПЦР [2] [3]. Перед секвенированием древнюю ДНК подвергают специальной обработке, чтобы удалить продукты дезаминирования и поперечные сшивки. Средняя длина амплифицируемых фрагментов древней ДНК часто не превосходит 100 п.н., причём для находок из одного места раскопок средняя длина фрагментов убывает с увеличением возраста находки. Современные протоколы секвенирования дДНК учитывают эту особенность; в частности, вместо отжига праймеров на фрагменты ДНК к концам фрагментов присоединяются адаптеры, а праймерами служат олигонуклеотиды, комплементарные адаптерам [4].

При низких температурах деградация ДНК идет медленнее, что обеспечивает хорошую сохранность ДНК в образцах, найденных в районе вечной мерзлоты. Однако считается, что даже в идеальных условиях ДНК не может сохраняться на протяжении более 1 млн лет [2] [3].

Контаминация

Под контаминацией понимается попадание в образец чужеродной ДНК во время захоронения, при извлечении, хранении или исследовании. Часто вследствие контаминации лишь малая доля ДНК в образце имеет эндогенное происхождение. Лучшие в этом отношении образцы содержат до 90 % эндогенной ДНК. [1]

Археологические образцы всегда содержат некоторое количество ДНК бактерий и грибов, которые колонизируют останки, пока те лежат в земле. Кроме того, в процессе исследования древней ДНК в образец может попасть человеческая или микробная ДНК, присутствующая в любой лаборатории. В отличие от древней ДНК современная хорошо амплифицируется при ПЦР. Продукты ПЦР, содержащие амплифицированную современную ДНК, могут распространиться по лаборатории и увеличить таким образом степень контаминации [1] [3]. Для профилактики лабораторной контаминации рекомендуется продолжительная обработка оборудования ультрафиолетом или кислотой и соблюдение требований протокола работы в ПЦР-лабораториях. Исследование древней ДНК не должно проводиться в лаборатории, где ранее изучались современные образцы, особенно близких видов. Хорошим способом убедиться (и убедить научное сообщество) в истинности результатов является повторение исследования в другой лаборатории [3]. Многие археологические образцы, особенно найденные давно, подверглись контаминации в процессе извлечения и исследования. Если образец был найден несколько десятилетий назад, человеческая ДНК, которой он загрязнен, может обладать всеми признаками древней ДНК. Кости и зубы имеют пористую поверхность, что делает проблематичной их очистку от современной ДНК. Волосы оказываются в этом отношении предпочтительнее: содержащаяся в них ДНК малодоступна для бактерий, а гидрофобная поверхность позволяет очистить их перед извлечением ДНК [1]. В этом случае совпадение последовательностей, полученных в результате независимого исследования разных частей образца (например, бедра и зубов) в разных лабораториях свидетельствует в пользу истинности результата [3].

В случае человеческих останков контаминация современной человеческой ДНК может приводить к ошибкам при исследовании филогении и популяционной генетики. Существует статистический метод, позволяющий отличать древнюю ДНК от современной по паттерну дезаминирования [5]. Если известно, что образец ДНК принадлежит женщине, можно картировать отсеквенированные последовательности на Y-хромосому и детектировать таким образом попадание в образец мужской ДНК [6]. Если исследуется ДНК нечеловеческого происхождения, очевидным способом проверки на контаминацию является картирование полученных при секвенировании чтений на человеческий геном, а также на геномы других организмов в случае, если они могли быть источниками контаминации. При секвенировании древней бактериальной ДНК проблема состоит также в том, что известны геномы далеко не всех существующих ныне бактерий, так что из того, что полученная последовательность не входит в известные бактериальные геномы, нельзя заключить, что она принадлежит древней бактерии, а не получена в результате контаминации [3].

Вставки мтДНК и хпДНК в хромосомах

Вставки митохондриальной и пластидной ДНК часто встречаются в ядерной ДНК. При исследовании древних образцов ДНК нельзя выделить ДНК органелл, поэтому эти вставки могут быть источником ошибок, так как их не всегда легко отличить по последовательности от настоящей мтДНК или хпДНК. Если такие вставки будут приняты за ДНК органелл, это может исказить результаты исследования филогении или популяционной генетики [3].

другие языки
català: ADN fòssil
Deutsch: ADNA
English: Ancient DNA
español: ADN antiguo
français: ADN fossile
italiano: DNA antico
polski: Antyczny DNA
português: DNA antigo
українська: Стародавня ДНК