Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción


En 1985, Sir Alec Jeffreys descubrió los “polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción que en biología molecular, el término RFLP (del inglés Restriction Fragment Length Polymorphism) se refiere a secuencias específicas de nucleótidos en el ADN que son reconocidas y cortadas por las enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de restricción) y que varían entre individuos. En un cromosoma humano, una enzima de restricción puede producir un gran número de cortes en los lugares donde reconozca la secuencia específica para hacerlo. Las secuencias de restricción presentan usualmente patrones de distancia, longitud y disposición diferentes en el ADN de diferentes individuos de una población, por lo que se dice que la población es polimórfica para estos fragmentos de restricción. Los RFLP son marcadores génicos del ADN y se pueden encontrar en regiones que codifican proteínas o exones, en los intrones o en el ADN que separa un gen de otro. Lo único que se necesita para que puedan ser marcadores genéticos es que sean polimórficos teniendo más de un alelo. La técnica RFLP se usa como marcador para identificar grupos particulares de personas con riesgo a contraer ciertas enfermedades genéticas, en ciencia forense, en pruebas de paternidad y en otros campos, ya que puede mostrar la relación genética entre individuos.

Metodología

El ADN de un individuo se extrae y se purifica. El ADN purificado puede ser amplificado usando la técnica molecular Reacción en cadena de la polimerasa o PCR (del inglés Polymerase Chain Reaction), luego tratado con enzimas de restricción específicas para producir fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Estas enzimas de restricción hacen un proceso de digestión restrictiva en el cual reconocen cortas secuencias específicas en el ADN donde cortan formando fragmentos de distintas longitudes. Los fragmentos de restricción se separan mediante electroforesis en geles de agarosa a través del cual corren debido a un campo eléctrico y su disociación obedece a la masa o a la carga eléctrica de las muestras según la técnica utilizada. Esto proporciona un patrón de bandas que es único para un ADN en particular debido a la diferencia en las secuencias del ADN en los individuos donde los sitios de restricción varían.Por tanto, se trata de un técnica codominante ya que nos permite distinguir individuos homocigotos de aquellos heterocigotos, es decir, nos permite observar cada uno de los alelos que estudiamos. En el gel podemos observar que hay dos alelos de distinto tamaño, y nos permite distinguir entre ambos individuos. Las bandas pueden ser transferidas por Southern Blot a una membrana donde se hibridan con una sonda que permite determinar la longitud y la separación de los fragmentos. En este paso las cadenas de ADN tienen que estar desnaturalizadas, es decir, en forma de cadena sencilla para permitir la hibridación con las sondas específicas. Las endonucleasas de restricción en su mayoría cortan el ADN de cadena doble en secuencias específicas y cada enzima reconoce un sitio en particular. Un ejemplo es la EcoRI: corta solamente cuando encuentra la secuencia 5`…G/AATTC…3` en la doble hélice. Para esta técnica, es importante seleccionar endonucleasas que corten en sitios específicos y no sea en secuencias degeneradas.

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