Espectrofotometría

Espectrofotómetro UV-VIS.

La espectrofotometría es la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda; es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones bioquímicas y síntesis químicas. El espectrofotómetro es un instrumento que cuantifica la cantidad de energía absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

Principios

En la espectrofotometría se aprovecha la absorción de radiación electromagnética en la zona del ultravioleta y visible del espectro. La muestra absorbe parte de la radiación incidente en este espectro y promueve la transición del analito hacia un estado excitado, transmitiendo un haz de menor energía radiante. En esta técnica se mide la cantidad de luz absorbida como función de la longitud de onda utilizada. La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica de cada sustancia química.

La espectrofotometría ultravioleta-visible utiliza haces de radiación del espectro electromagnético, en el rango UV de 180 a 380 nm, y en el de la luz visible de 380 a 780 nm, por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la región ultravioleta y visible del espectro.

Ley de Lambert

La ley de Lambert trata sobre la iluminancia de una superficie situada a una cierta distancia de una fuente de luz. Determina que la iluminación producida por una fuente luminosa sobre una superficie es directamente proporcional a la intensidad de la fuente y al coseno del ángulo que forma la normal a la superficie con la dirección de los rayos de luz y es inversamente proporcional al cuadrado de la distancia a dicha fuente.

Ley de Lambert-Beer

La ley de Lambert-Beer afirma que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la solución.

Por ejemplo, en un vaso de vidrio tenemos agua con azúcar disuelta y en otro vaso tenemos la misma cantidad de agua pero con mayor cantidad de azúcar en solución. El detector es una celda fotoeléctrica, y lo que se mide es la concentración de la solución de azúcar.

Según la ley de Beer, si hiciéramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de luz que saldría del otro lado sería mayor que si repitiéramos esto en el segundo, ya que en este último las ondas electromagnéticas chocan contra un mayor número de átomos o/y moléculas y son absorbidos por estos.[1]

Ley de Bouguer-Beer-Lambert

Una ley muy importante es la de Bouguer-Beer-Lambert (también conocida como ley de Lambert Bouguer y Beer), la cual es solo una combinación de las citadas anteriormente.

Transmitancia y absorción de las radiaciones

Por las leyes mencionadas anteriormente, al hacer pasar una cantidad de fotones o de radiaciones hay una pérdida que se expresa con la ecuación:

It/Io=T-kdc''

donde It es la intensidad de luz que sale de la cubeta y que va a llegar a la celda fotoeléctrica (llamada radiación o intensidad transmitida); Io es la intensidad con la que sale al atravesar la celda (radiación intensidad incidente), y la relación entre ambas (T) es la transmitancia.

En el exponente, el signo negativo se debe a que la energía radiante decrece a medida que el recorrido aumenta. El superíndice k es la capacidad de la muestra para la captación del haz del campo electromagnético, d es la longitud de la cubeta de espectrofotometría que recorre la radiación, y c es la concentración del soluto en la muestra ya ubicada en la cubeta.

La ecuación simplificada de la ley de Lambert-Beer

A = ε.d.c

comprende la mínima ecuación que relaciona la concentración (c), la absorbancia de la muestra (A), el espesor recorrido por la radiación (d) y el factor de calibración (ε). El factor de calibración relaciona la concentración y la absorbancia de los estándares.

La absorción (o absorbancia) es igual a A, que es el logaritmo recíproco de la transmitancia:[2]

A= log 1/T

lo que es igual a:

A= -log T

Las ecuaciones mencionadas de las leyes son válidas solo y solo si:[2]

  • la radiación incidente es monocromática;
  • las especies actúan independientemente unas de otras durante la absorción;
  • la absorción ocurre en un volumen de sección trasversal uniforme.
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