Enzima de restricción

Un enzima de restricción (o endonucleasa de restricción) es aquella que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restricción, o en un sitio no muy lejano a este. Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y 6 pares de bases, con las que son reconocidos.

El mecanismo del corte de ADN se realiza a través de la ruptura de dos enlaces fosfodiéster en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos de DNA. Estos pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o cohesivos/escalonados. Estos últimos tienen tendencia a volver a unirse de modo espontáneo, ya que los extremos se pueden unir a otros extremos coincidentes que pueda haber en la cercanía ( Apareamiento de Watson & Crick).

Corte de EcoRI dejando extremos cohesivos.
Restricción de SmaI dejando extremos romos.

Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas llamadas ligasas.

Las enzimas de restricción que a pesar de ser distintas y provenir de distintas especies, tienen la misma secuencia de reconocimiento y dejan el mismo extremo cohesivo, pero no cortan en el mismo sitio, son llamadas isoesquizómeros. Por ejemplo, están los isoesquizómeros Asp718 y KpnI.

El Premio Nobel de Medicina de 1978 fue concedido a los Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith por el descubrimiento de las endonucleasas de restricción lo que condujo al desarrollo de la tecnología de ADN recombinante. El primer uso práctico de su trabajo fue la manipulación de la bacteria E. coli para producir insulina humana para los diabéticos.

Uno de los campos en los que las enzimas de restricción han tenido mayor implicación ha sido el diagnóstico de enfermedades genéticas relacionadas con cambios en la secuencia del ADN, ya sean mutaciones puntuales, inserciones o deleciones de fragmentos. Si éstas se producen en un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción, al producirse eliminarán o agregarán nuevos sitios de corte. Al aplicar esta enzima al gen de una persona sana y una enferma se deberían observar distintas cantidades de fragmentos para cada caso en una electroforesis.

Sistemas de restricción-modificación (M-R)

El sistema de restricción-modificación (M-R) es usado in vivo por bacterias para protegerse de ataques de DNA exógenos (normalmente víricos) que ingresen en la bacteria, eliminando las secuencias ajenas al genoma de estas. El ADN propio no sufre deleción por parte de las enzimas de restricción del organismo que las produce, puesto que previamente ha sido modificado por metilación a través de la acción de una metiltransferasa, enzima que transfiere grupos metilo desde S-adenosil-metionina (SAM) a bases específicas. Este sistema fue descubierto en 1968, a resultas de una serie de estudios sobre la infección del fago l en dos cepas diferentes de Escherichia coli (las llamadas cepas “K12” y “B”). Este sistema consta de dos partes:

  • Restricción: Este sistema le permite a la bacteria protegerse de DNA exógenos para evitar la “promiscuidad” en los intercambios genéticos. Esto le confiere inmunidad frente a bacteriofagos que pudieran poner en peligro la individualidad genética o incluso la vida de la bacteria, lo que se realiza a través de cortes mediante endonucleasas de restricción a los DNA exógenos que ingresen a la bacteria.
  • Modificación: Consiste en la introducción de grupos metilo (CH3-) en determinadas bases dentro de determinadas secuencias del ADN, lo cual está catalizado por una metilasa específica.

Existen varios mecanismos de acción generales de estos sistemas, de los cuales destacan el tipo I y el tipo II:

  • M-R tipo I: Fueron los primeros en ser descritos. Lo característico de los sistemas M-R de tipo I es que las actividades de modificación y las de restricción están producidas por un complejo multiproteico, que realiza los dos tipos de actividades. Algunas características son:
  • Reconocen secuencias relativamente grandes que no presentan simetrías.
  • La actividad de restricción (de las subunidades R) corta lejos del sitio de reconocimiento (del orden de unos 1000 pb), y en lugares inespecíficos.
  • La restricción requiere de ATP.
  • La actividad metilasa del complejo hace uso de S-adenosil-metionina (SAM) como donador de los grupos metilo.
  • M-R tipo II: Aquí cada subunidad del dímero reconoce la misma secuencia, presente en cada una de las partes especulares del palíndromo, y realiza un corte en un lugar específico, que obviamente tiene su correspondiente en la otra cadena de la otra mitad del palíndromo. Más de la tercera parte de las cepas bacterianas presentan al menos un sistema M-R de tipo II. Muchas de ellas son codificadas a partir de genes situados en plásmidos. Algunas características que tiene este mecanismo son:
  • Las dos actividades las realizan dos proteínas distintas que no forman complejos multiproteicos.
  • No utilizan ATP. Sólo necesitan iones Mg++ para funcionar. La metilasa usa SAM como donador de metilos.
  • Cada miembro de la pareja de modificación y restricción reconoce la misma secuencia específica de ADN.
  • El sitio de reconocimiento consta de 4 ó 6 pb que constituyen una secuencia palindrómica.
  • La metilasa suele ser una proteína monomérica, que introduce grupos metilo en una A o en una G (según la metilasa en cuestión), en ambas cadenas, dentro del sitio de reconocimiento.
  • La enzima de restricción suele ser una proteína formada por dos subunidades del mismo tipo, ensambladas simétricamente. Pueden dejar extremos cohesivos o extremos romos. Algunas enzimas de restricción dejan extremos sobresalientes 5', mientras que otras dejan extremos sobresalientes 3'.
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